一、 FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)功能特點

由于葉綠素熒光技術(shù)本身在科學研究中有一系列的局限性。因此從上世紀八十年代末開始，隨著Charge-Coupled Device(CCD)成像技術(shù)、LED光源板技術(shù)、圖像分析技術(shù)的成熟，不斷有科學家和工程師合作探索將這三項技術(shù)與PAM脈沖調(diào)制技術(shù)結(jié)合，進而將葉綠素熒光技術(shù)升級為葉綠素熒光成像技術(shù)（Daley et al. 1989; Raschke et al. 1990; Mott et al. 1993; Genty and Meyer 1994; Bro et al. 1995; Siebke and Weis 1995; Meyer and Genty 1998; Balachandran et al. 1994; Oxborough and Baker 1997）。

20世紀90年代末，PSI科學家Nedbal和PSI總裁Trtilek等合作，成功研制了與PAM脈沖調(diào)制技術(shù)結(jié)合的FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)（Nedbal et al., 2000），并推出第一臺商業(yè)化葉綠素熒光成像設(shè)備FluorCam。

這一發(fā)明正式開啟了葉綠素熒光研究的二維時代。FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)成為上世紀90年代葉綠素熒光技術(shù)的重要突破，使科學家們對光合作用與葉綠素熒光的研究一下子進入二維世界，并得到了國際科學界的一致認可。

與之前的葉綠素熒光技術(shù)相比，FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)的主要優(yōu)勢有：

· 能夠全面反映整株植物、葉片、藻類群體等的不同位置熒光強度變化與分布。

· 可測量葉片、果實、麥穗、大型藻/微藻、整株植物乃至植物冠層等各種樣品。

· 可同時測定幾十、甚至上百株個樣品。

· 能夠在顯微水平研究葉綠體或藻類細胞。

· 尤其適用于環(huán)境脅迫早期植物不同部位光合活性的變化規(guī)律、突變體不同部位的光合功能差異等研究。

同時，FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)與同類技術(shù)相比具備以下優(yōu)勢：

· 由真正的生物學家、數(shù)學家、電子工程師和光學工程師組成的研發(fā)團隊所開發(fā)

· FluorCam是脈沖調(diào)試式葉綠素熒光成像技術(shù)的最早實用化成果

· 國際葉綠素熒光成像技術(shù)，僅2019-2021.3可查閱全文的SCI文獻就有300篇以上

· 可實現(xiàn)高通量植物表型分析、抗性篩選、種質(zhì)資源檢測等科研應(yīng)用

· 激發(fā)熒光的LED光源板和獲取熒光數(shù)據(jù)的成像傳感器不但技術(shù)而且為PSI自行開發(fā)，具備*自主知識產(chǎn)權(quán)

· 測量及成像參數(shù)最多，具備葉綠素熒光顯微成像、OJIP快速熒光動力學曲線、QA再氧化動力學、熒光蛋白活體成像、多光譜熒光成像、無人值守自動監(jiān)測、圖像閾值分割等世界的成像測量功能

· 以FluorCam葉綠素熒光成像技術(shù)為核心的PlantScreen植物表型成像分析系統(tǒng)為目前安裝最多的植物表型組學研究系統(tǒng)

· 軟件由PSI開發(fā)，為客戶提供升級服務(wù)

· PSI表型科研中心可進行科研合作并提供實驗指導

· 系統(tǒng)型號全面，適用于各種實驗需求

· 幾乎無維護費用

技術(shù)功能特點：

1) 儀器型號和配置靈活多樣，測量樣品涵蓋了從葉片、藻類、果實、花朵、整株植物、植物群體/冠層乃至單個微藻/植物細胞、葉綠體等幾乎所有不同類型的宏觀和微觀植物樣品，甚至還包括含有葉綠素的細菌和海洋生物；同時滿足了從實驗室光合機理精細研究到野外大田實地研究，從自然環(huán)境到精確可控環(huán)境等不同實驗條件和尺度的要求。

2) 高靈敏度CCD，時間分辨率可達50幀／秒，分辨率720×560像素；可選配高分辨率CCD，最高分辨率1360×1024像素，在最高圖像分辨率下時間分辨率可達20幀／秒，用于穩(wěn)態(tài)熒光如GFP熒光測量等；超高靈敏度成像傳感器，最高分辨率1280×1024像素，最高時間分辨率高達16000幀／秒，真正實現(xiàn)了OJIP快速熒光誘導動力學曲線的成像測量

3) 具備完備的自動測量程序（protocol），可自由對自動測量程序進行編輯

a) Fv/Fm：測量參數(shù)包括Fo，Fm，Fv，QY等

b) Kautsky誘導效應(yīng)：Fo，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd等熒光參數(shù)

c) 熒光淬滅分析：Fo，Fm，Fp，Fs，Fv，QY，Φ_II，NPQ，Qp，Rfd，qL等50多個參數(shù)

d) 光響應(yīng)曲線：Fo，Fm，QY，QY_Ln，ETR等熒光參數(shù)

e) PAR吸收率、NDVI成像測量（選配）

f) GFP、YFP、EBFP、CFP、DsRed等熒光蛋白與DAPI等熒光染料的熒光定量測量（選配）

g) 多光譜熒光測量（選配）：F440、F520、F690、F740

h) QA再氧化動力學曲線（選配）

i) OJIP快速熒光誘導動力學曲線（選配）：Fo，Fj，Fi，P或Fm，Mo（OJIP曲線初始斜率）、OJIP固定面積、Sm（對關(guān)閉所有光反應(yīng)中心所需能量的量度）、QY、PI等參數(shù)

4) 自動重復實驗功能，可無人值守自動循環(huán)完成選定的實驗程序，重復次數(shù)及間隔時間客戶自定義，成像測量數(shù)據(jù)自動按時間日期存入計算機

5) 標配4個LED光源板，采用大型預封裝LED光源，紅/藍或紅/白雙色光化光源，可選配其他不同顏色（波長）、不同光強LED光源

6) 功能強大的FluorCam葉綠素熒光成像分析軟件功能：具Live（實況測試）、Protocols（實驗程序選擇定制）、Pre–processing（成像預處理）、Result（成像分析結(jié)果）等功能菜單：

7) 數(shù)據(jù)分析具備“信號計算再平均"模式（算數(shù)平均值）和“信號平均再計算模式"兩種功能模式，在高信噪比的情況下選用“信號計算再平均"模式，在低信噪比的情況下選擇“信號平均再計算"模式以過濾掉噪音帶來的誤差

8) 輸出結(jié)果：高時間解析度熒光動態(tài)圖、熒光動態(tài)變化視頻、熒光參數(shù)Excel文件、直方圖、不同參數(shù)成像圖、不同ROI的熒光參數(shù)列表等

二、 FluorCam葉綠素熒光成像系統(tǒng)型號

1. FluorCam便攜式葉綠素熒光成像儀

· 可測量葉綠素熒光成像，可選配GFP熒光蛋白成像功能

· 成像面積：便攜式FluorCam 31.5mm×41.5 mm、便攜式GFPCam 35mm×46 mm

· 配備專用支架和電池包，便攜性強，實驗室、野外均可使用

· 可編輯測量實驗程序（protocol）

· 具備自動重復測量功能

· 配備專用暗適應(yīng)葉夾，便于在野外對樣品進行暗適應(yīng)無損測量

2. FluorCam封閉式葉綠素熒光成像系統(tǒng)

· FluorCam系列中功能全面，使用便捷的型號

· 系統(tǒng)集成于暗適應(yīng)操作箱內(nèi)，操作簡便、便于移動，既可在實驗室內(nèi)也可在室外進行暗適應(yīng)成像測量分析

· 高靈敏度CCD鏡頭，時間分辨率達50張每秒，快速捕捉葉綠素熒光瞬變；可選配高分辨率CCD用于穩(wěn)態(tài)熒光如GFP熒光測量；也可選配超高靈敏度成像傳感器，實現(xiàn)真正的OJIP快速熒光誘導動力學曲線成像測量

· 成像面積達13×13cm，可對植物葉片、植物組織、藻類、苔蘚、地衣、整株植物或多株植物、96孔板、384孔板等進行成像分析

· 飽和光光強最高達6000 µmol(photons)/m2.s，進行QA再氧化分析使用的單周轉(zhuǎn)飽和光閃STF可達120000µmol(photons)/m2.s

· 世界上可進行OJIP快速熒光動力學成像分析的葉綠素熒光技術(shù)設(shè)備

· 世界上可進行QA再氧化動力學成像分析的葉綠素熒光技術(shù)設(shè)備

· 具備功能的、可編輯的葉綠素熒光實驗程序（Protocols），包括快照模式、Fv/Fm、Kautsky誘導效應(yīng)、葉綠素熒光淬滅分析、LC光響應(yīng)曲線、PAR吸收與NDVI成像分析、QA再氧化動力學分析、OJIP快速熒光動力學分析及GFP綠色熒光蛋白成像等

· 可選配GFP、YFP、BFP、RFP、CFP、DAPI等熒光蛋白與熒光染料成像

· 可進行自動重復成像測量分析

· 4塊大型高強度封裝LED光源板，具備雙色光化光，標配為2紅光+2白光，可選配2紅光+2藍光或其它波長光源組合

3. FluorCam開放式葉綠素熒光成像系統(tǒng)

· 模塊化設(shè)計，配置靈活，可自由安裝更換光源板、自由調(diào)整光源角度和高度、自由調(diào)整CCD鏡頭高度，方便被測植物的處理、操作等

· 4塊大型高強度封裝LED光源板，具備雙色光化光，標配為2紅光+2白光，可選配2紅光+2藍光或其它波長光源組合

· 可自由選配多種備用不同波長LEDs光源板，用戶可簡便自行更換，如選配青色光源板用于氣孔功能研究、選配紫外光源板用于多光譜熒光成像測量等

· 可進行GFP、YFP、BFP、RFP、CFP、DAPI等熒光蛋白與熒光染料成像

· 標準版成像面積13×13cm，大型版成像面積達20×20cm，可對整株植物甚至多株植物（如擬南芥等小型植物）進行實驗成像分析

· 高靈敏度CCD鏡頭，時間分辨率達50張每秒，快速捕捉葉綠素熒光瞬變，可選配高分辨率CCD用于穩(wěn)態(tài)熒光如GFP熒光測量

4. FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)

FluorCam多光譜成像系統(tǒng)是將穩(wěn)態(tài)熒光成像技術(shù)與脈沖調(diào)制式葉綠素熒光成像技術(shù)融于一體，能夠在一臺儀器上實現(xiàn)GFP、BFP、CFP、YFP、RFP等熒光蛋白成像、DAPI等熒光染料成像、熒光素酶、脈沖調(diào)制式葉綠素熒光成像以及NDVI反射光譜成像分析功能，是真正功能全面的植物熒光活體成像系統(tǒng)。同時，除了植物樣品外，植物熒光活體成像系統(tǒng)也可以進行藻類、珊瑚共生體、菌落乃至動物的熒光成像分析。

· 1360×1024像素高分辨率CCD，可對樣品熒光標記的分布進行精準成像分析

· 標準版成像面積13×13cm，大型版成像面積達20×20cm，可對整株植物甚至多株植物（如擬南芥等小型植物）進行實驗成像分析

· 專用熒光激發(fā)光源組與濾波器組合，精確測量不同熒光蛋白標記

· 軟件配置多種用戶自定義調(diào)色板，可生成真實色彩成像圖或?qū)Ρ仍鰪姴噬上駡D

· 可選配新型FluorCam-Pro植物多光譜熒光成像系統(tǒng)，一體化完成各種熒光成像測量  

5. FKM多光譜熒光動態(tài)顯微成像系統(tǒng)

· 目前用于植物/藻類顯微葉綠素熒光成像研究的成熟商用儀器

· 內(nèi)置現(xiàn)今葉綠素熒光研究的全部程序，如Fv/Fm、Kautsky誘導效應(yīng)、熒光淬滅、OJIP快速熒光響應(yīng)曲線、QA再氧化等，可獲得70余項參數(shù)

· 配備10倍、20倍、40倍、63倍和100倍專用生物熒光物鏡，可以清晰觀測到葉綠體及其發(fā)出的熒光

· 激發(fā)光源組中包括紅外光、紅光、藍光、綠光、白光、紫外光和遠紅光等，通過紅藍綠三色光還可以調(diào)出可見光譜中的任何一種色光，能夠研究植物/藻類中任何一種色素分子或發(fā)色團。

· 可進行GFP、DAPI、DiBAC4、SYTOX、CTC等熒光蛋白、熒光染料的成像分析

· 高分辨率光譜儀能夠深入解析各種熒光的光譜圖

· 控溫系統(tǒng)可以保證實驗樣品在同等溫度條件下進行測量，提高實驗精度，也可以進行高溫/低溫脅迫研究

6. FluorCam大型葉綠素熒光成像平臺

· 世界上單幅成像面積最大的脈沖調(diào)制式（PAM）葉綠素熒光成像系統(tǒng)，成像光源板面積70×70cm，成像面積達35×35cm，可對整株植物及多株植物同時進行非損傷性葉綠素熒光成像分析

· LED激發(fā)光源、CCD葉綠素熒光成像鏡頭及濾波輪等集成于一個高度可自由移動的成像平臺上，成像平臺高度可調(diào)，以適應(yīng)于不同高度的植物成像分析

· 可選配PAR吸收／NDVI成像分析模塊，對植物PAR吸收及光譜反射指數(shù)NDVI進行成像分析

· 可選配RGB成像分析模塊,用于植物形態(tài)測量分析等

· 可選配GFP綠色熒光蛋白成像分析功能，用于植物轉(zhuǎn)基因研究

三、FluorCam葉綠素熒光成像系統(tǒng)應(yīng)用案例

1. 擬南芥葉綠體R-loop調(diào)控機制

2017年清華大學生命學院孫前文課題組通過分析獲得一個新的定位于葉綠體中的核糖核酸酶H蛋白（AtRNH1C），發(fā)現(xiàn)該蛋白可以調(diào)節(jié)葉綠體中R-loop水平的變化，從而維持基因組的穩(wěn)定性和發(fā)育。他們使用FluorCam封閉式葉綠素熒光成像系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)AtRNH1C對葉綠體的發(fā)育有重要作用。

在使用喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星（CIP）處理后，通過FluorCam葉綠素熒光成像圖可以直觀發(fā)現(xiàn)野生型的生長被抑制，同時葉片變色。而atrnh1c突變體則加強了CIP的毒害效應(yīng)。這更加證實了AtRNH1C的功能。本實驗的熒光成像檢測是在易科泰Ecolab實驗室完成的。

2020年，孫前文課題組又使用FluorCam封閉式葉綠素熒光成像系統(tǒng)結(jié)合分子實驗結(jié)果，證實了R-loop解旋酶過表達能夠拯救由于異常累積HO-TRC觸發(fā)R-loop共同表達造成的缺陷，從而維持擬南芥葉綠體基因組完整性。

參考文獻：

1. Yang Z, et al. 2017. RNase H1 Cooperates with DNA Gyrases to Restrict R-loops and Maintain Genome Integrity in Arabidopsis Chloroplasts. The Plant Cell, doi:10.1105/tpc.17.00305

2. Yang Z, et al. 2020. RHON1 Co-transcriptionally Resolves R-Loops for Arabidopsis Chloroplast Genome Maintenance. Cell Reports 30: 243–256

2. 構(gòu)建耐鹽生菜品種表型鑒定體系

目前，全球農(nóng)業(yè)都受到土壤和灌溉水鹽分升高的威脅。大約50%的灌溉農(nóng)田都受到了鹽分的影響。2013年的經(jīng)濟分析指出由于鹽分誘發(fā)的土壤退化和作物產(chǎn)量損失在全球造成了273億美元的損失。作為一種重要的蔬菜作物，生菜（Lactuca sativa L.）在世界范圍內(nèi)都進行了廣泛的種植。生菜產(chǎn)量最高的國家為美國、歐盟和中國。而生菜對鹽分脅迫非常敏感的。鹽分脅迫會造成生菜生物量減少、誘發(fā)葉燒病和早衰等。

美國農(nóng)業(yè)部（USDA）的科學家嘗試確定生菜鹽脅迫的關(guān)鍵生理表型性狀，用于篩選高耐鹽的生菜品種，希望從這些數(shù)據(jù)中篩選出的指標構(gòu)建耐鹽生菜品種表型鑒定體系。與傳統(tǒng)作物表型測量相比，一方面光系統(tǒng)對各種生物和非生物脅迫因素都非常敏感，而葉綠素熒光成像分析可以無損地直接測量脅迫對光系統(tǒng)的損傷程度和機理，在脅迫初期乃至癥狀出現(xiàn)前即可檢測到脅迫的發(fā)生；另一方面，葉綠素熒光成像分析技術(shù)與自動傳送系統(tǒng)集合，能夠?qū)崿F(xiàn)對大量樣品的高通量無損快速檢測，非常適用于作物品種的篩選。他們使用的PlantScreen XYZ植物表型成像分析系統(tǒng)就能夠?qū)⑦@兩方面的優(yōu)勢地結(jié)合起來。其樣帶式FluorCam葉綠素熒光成像單元是目前使用脈沖調(diào)制式葉綠素熒光成像技術(shù)實現(xiàn)大型整株植物測量的商用化儀器。自動傳送系統(tǒng)可以自動調(diào)整成像單元的位置與高度，結(jié)合專用軟件可以對幾十株乃至上百株樣品進行自動葉綠素熒光成像分析。

實驗中使用了球生菜、奶油生菜、直立生菜、葉生菜等不同的栽培品種和生菜的野生親緣種L. serriola L，共240株樣品。這些品種中既有耐鹽品種，也有鹽脅迫敏感品種。所有樣品在同樣鹽脅迫處理下進行了葉綠素熒光成像分析。研究者重點分析了QY_max（Fv/Fm）最大光化學效率、Fv/Fm_L（Fv’/Fm’）光適應(yīng)最大光化學效率、NPQ非光化學淬滅（最大熒光）、qN非光化學淬滅（可變熒光）、qP光化學淬滅、QY實際光化學效率（量子產(chǎn)額）、Rfd熒光衰減比率等熒光參數(shù)。

值得一提的是，葉綠素熒光成像圖經(jīng)過校準后，還可以直接獲得整株植物具備光合活性的葉面積。結(jié)合熒光參數(shù)還可以對葉面積進行不同脅迫程度的定量分級和圖像分割。本研究中直接使用葉綠素熒光成像獲得的光合活性葉面積取代了傳統(tǒng)測量的葉面積。

熒光數(shù)據(jù)與鮮重等傳統(tǒng)表型數(shù)據(jù)進行了相關(guān)性分析和主成分分析，結(jié)果表明敏感栽培種的葉綠素熒光特征是低QY，qN，NPQ和Rfd，而耐受栽培種的特征是高QY_max，Fv/Fm_L和QY_D。與葉綠素熒光參數(shù)的高靈敏度相比，大多數(shù)樣品的葉綠素指數(shù)和CO₂同化速率在鹽脅迫處理前后都沒有表現(xiàn)出顯著的差異。因此，研究者建議在篩選高耐受品系時以較高的葉面積配合較高的Fv/Fm和QY作為初篩指標。

后續(xù)，美國農(nóng)業(yè)部又使用加裝了高光譜成像單元的PlantScreen表型成像系統(tǒng)與FluorCam結(jié)合，通過葉綠素熒光成像數(shù)據(jù)與高光譜成像數(shù)據(jù)繪制了生菜水分脅迫響應(yīng)基因位點的分子圖譜。

參考文獻：

1. Adhikari N D, et al. 2019. Phenomic and Physiological Analysis of Salinity Effects on Lettuce. Sensors, 19: 4814

2. Kumar P, et al. 2021. Molecular Mapping of Water-Stress Responsive Genomic Loci in Lettuce (Lactuca spp.) Using Kinetics Chlorophyll Fluorescence, Hyperspectral Imaging and Machine Learning. Front. Genet. 12: 634554