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FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)應(yīng)用案例——什么是多光譜熒光成像
發(fā)布時間： 2020-05-20 點(diǎn)擊次數(shù)： 2605次1. 多光譜熒光的發(fā)現(xiàn)及特性
二十世紀(jì)八九十年代，植物生理學(xué)家對植物活體熒光——主要是葉綠素?zé)晒庋芯坎粩嗌钊?。激發(fā)葉綠素?zé)晒庵饕鞘褂眉t光、藍(lán)光或綠光等可見光。當(dāng)科學(xué)家使用UV紫外光對植物葉片進(jìn)行激發(fā)，發(fā)現(xiàn)植物產(chǎn)生了具備4個特征性波峰的熒光光譜。
圖1. 左：煙草葉片上表面UV激發(fā)熒光光譜（Buschmann，1998）；中：多光譜熒光彩色光譜示意圖；右：不同顏色激發(fā)光的熒光激發(fā)特性（Benediktyová, 2009）
這4個特征性波峰的波長分別為藍(lán)光440nm（F440）、綠光520nm（F520）、紅光690nm（F690）和遠(yuǎn)紅外光740nm（F740）。這個特征激發(fā)熒光光譜就稱為多光譜熒光（Multi-color Fluorescence，MCF）。其來源和熒光特性請見表1。
表1.UV激發(fā)多光譜熒光特性（Buschmann，1998，略有修改）
A．藍(lán)綠熒光（Blue-Green Fluorescence，BGF）
熒光色素：
主要是細(xì)胞壁中共價結(jié)合的阿魏酸，由液泡中的肉桂酸和類黃酮調(diào)控
位置和來源：
a）細(xì)胞壁（主要來自于葉片表皮）
b）液泡（與溶解的酚類有相互作用）
激發(fā)：
UV
熒光特性：
輻射范圍：
400-570nm
大值（波峰）：
440-450nm（藍(lán)光，F(xiàn)440），520-530nm（綠光，F(xiàn)520）
脅迫指示：
藍(lán)色熒光與紅色和遠(yuǎn)紅熒光比例：F440/F690，F(xiàn)440/F740的增加或減少；某些植物中綠色熒光的增加
B．葉綠素?zé)晒猓–hlorophyll Fluorescence，Chl. F）
熒光色素：
葉綠素a
位置和來源：
葉片葉肉細(xì)胞，葉綠體
激發(fā)：
紅光、綠光、藍(lán)光、UV等
熒光特性：
輻射范圍：
650-800nm
大值（波峰）：
690nm（紅光，F(xiàn)690），730-740nm（遠(yuǎn)紅光，F(xiàn)740）
脅迫指示：
短期脅迫：
熒光誘導(dǎo)動力學(xué)變化（通過葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)進(jìn)行分析），F(xiàn)690/F740增加30%
長期脅迫：
熒光誘導(dǎo)動力學(xué)變化（通過葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)進(jìn)行分析），葉綠素含量減少，F(xiàn)690/F740大幅增加。F690/F740是原位葉綠素含量的反向指標(biāo)。
2. 多光譜熒光的發(fā)展
進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，并稱為藍(lán)綠熒光（Blue-Green Fluorescence，BGF）的F440和F520在正常生長的植物中強(qiáng)度很低。而在植物受到脅迫尤其是病害感染后，其強(qiáng)度才會顯著上升。
與來源于光系統(tǒng)的葉綠素?zé)晒獠煌?，藍(lán)綠熒光來源于一系列植物次生代謝物質(zhì)，包括多酚、植保素、黃酮類、阿魏酸、苯丙素類等。這類物質(zhì)在植物生長狀態(tài)良好時含量很低，植物只有在受到脅迫后才會大量合成，這一方面是由于初級代謝受到抑制和干擾，另一方面這些次生代謝產(chǎn)物也是植物應(yīng)對脅迫尤其是病害防御機(jī)制的重要組成部分。
F690和F740則屬于葉綠素?zé)晒?，其?qiáng)度與葉綠素含量和光合電子傳遞相關(guān)。F690 ⁄ F740認(rèn)為與葉綠素濃度成負(fù)相關(guān)。同時F440 ⁄ F690，F(xiàn)440 ⁄ F740可以作為極早期脅迫指示指標(biāo)，F(xiàn)440 ⁄ F520則反映長期脅迫變化（Pineda, 2008）。
3. FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)
FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)是在FluorCam葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)基礎(chǔ)上擴(kuò)展升級而來的。這是目前上能夠進(jìn)行多光譜熒光成像分析的商用科研儀器技術(shù)，而且也是將多光譜熒光成像技術(shù)和葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)結(jié)合為一體的商用科研技術(shù)。
目前，基于FluorCam多光譜熒光成像技術(shù)有三款儀器系統(tǒng)，分別為FluorCam一體式多光譜熒光成像系統(tǒng)、FluorCam模塊式多光譜熒光成像系統(tǒng)、FluorCam落地式大型多光譜熒光成像平臺，用于滿足不同的實驗需求。
圖2. 左：FluorCam一體式多光譜熒光成像系統(tǒng)；中：FluorCam模塊式多光譜熒光成像系統(tǒng)；右：FluorCam落地式大型多光譜熒光成像平臺
FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)除了可以進(jìn)行多光譜熒光成像和葉綠素?zé)晒獬上穹治?，還可以擴(kuò)展GFP成像、PAR吸收率成像、NDVI成像、QA再氧化成像、OJIP成像等成像分析功能。
FluorCam多光譜熒光成像系統(tǒng)與紅外熱成像、高光譜成像等其他植物表型成像技術(shù)結(jié)合，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物病害（細(xì)菌、病毒、真菌）、干旱、養(yǎng)分虧缺、重金屬、除草劑等脅迫造成的次生代謝與表型組學(xué)研究，其中植物病害表型為主要的研究方向。
圖3.左；細(xì)菌性甘薯莖腐病感染煙草的FluorCam葉綠素?zé)晒馀c多光譜熒光成像分析；右：丁香假單胞菌感染菜豆的FluorCam多光譜熒光成像分析（Pérez-Bueno, 2016, 2015）
參考文獻(xiàn)：
1. Buschmann C, Lichtenthaler HK. 1998, Principles and characteristics of multi-colour fluorescence imaging of plants, Journal of Plant Physiology, 152: 297-314
2. Benediktyová, Z. & Nedbal, L. 2009. Imaging of multi–color fluorescence emission from leaf tissues. Photosynthesis research 102, 169-175
3. Pineda M, et al. 2008, Multicolor Fluorescence Imaging of Leaves—A Useful Tool for Visualizing Systemic Viral Infections in Plants, Photochemistry and Photobiology, 84: 1048-1060
4.Pérez-Bueno M L, et al. 2015, Spatial and temporal dynamics of primary and secondary metabolism in Phaseolus vulgaris challenged by Pseudomonas syringae, Physiologia Plantarum 153: 161-174.
5.Pérez-Bueno M L, et al. 2016. Temporal and Spatial Resolution of Activated Plant Defense Responses in Leaves of Nicotiana benthamiana Infected with Dickeya dadantii. Front Plant Sci. 6: 1209
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